A catalogue of biochemically diverse CRISPR-Cas9 orthologs.

Bacterial Cas9 nucleases from type II CRISPR-Cas antiviral defence systems have been repurposed as genome editing tools. Although these proteins are found in many microbes, only a handful of variants are used for these applications. Here, we use bioinformatic and biochemical analyses to explore this largely uncharacterized diversity. We apply cell-free biochemical screens to assess the protospacer adjacent motif (PAM) and guide RNA (gRNA) requirements of 79 Cas9 proteins, thus identifying at least 7 distinct gRNA classes and 50 different PAM sequence requirements. PAM recognition spans the entire spectrum of T-, A-, C-, and G-rich nucleotides, from single nucleotide recognition to sequence strings longer than 4 nucleotides. Characterization of a subset of Cas9 orthologs using purified components reveals additional biochemical diversity, including both narrow and broad ranges of temperature dependence, staggered-end DNA target cleavage, and a requirement for long stretches of homology between gRNA and DNA target. Our results expand the available toolset of RNA-programmable CRISPR-associated nucleases.

CRISPR-Cas9 Editing in Maize: Systematic Evaluation of Off-target Activity and Its Relevance in Crop Improvement.

CRISPR-Cas9 enabled genome engineering has great potential for improving agriculture productivity, but the possibility of unintended off-target edits has evoked some concerns. Here we employ a three-step strategy to investigate Cas9 nuclease specificity in a complex plant genome. Our approach pairs computational prediction with genome-wide biochemical off-target detection followed by validation in maize plants. Our results reveal high frequency (up to 90%) on-target editing with no evidence of off-target cleavage activity when guide RNAs were bioinformatically predicted to be specific. Predictable off-target edits were observed but only with a promiscuous guide RNA intentionally designed to validate our approach. Off-target editing can be minimized by designing guide RNAs that are different from other genomic locations by at least three mismatches in combination with at least one mismatch occurring in the PAM proximal region. With well-designed guides, genetic variation from Cas9 off-target cleavage in plants is negligible, and much less than inherent variation.

Application of DNA- and Protein-Based Detection Methods in Agricultural Biotechnology.

DNA- and protein-based detection methods are widely used tools for monitoring biotechnology-derived crops and their products globally. Agricultural biotechnology companies, food/feed suppliers and supply chains, diagnostic testing companies, and regulatory authorities heavily rely on these two technologies for product development, seed production, compliance, and contractual needs. The primary use of DNA- and protein-based detection methods is either to verify the presence or absence of genetically engineered (GE) materials or to quantify the amount of GE material present in a product. This review describes key parameters of DNA- and protein-based detection methods, and thorough assessment of their applications and their advantage and limitations in agricultural biotechnology are discussed in detail. The review highlights the principle and considerations of detection method selection, which will equip users to choose suitable technology and obtain reliable test results. The review also compares the compatibility of the two technologies in GE product testing using a case study.

Rapid detection of proteins in transgenic crops without protein reference standards by targeted proteomic mass spectrometry.

BACKGROUND: Liquid chromatography coupled with tandem mass spectrometry is increasingly used for protein detection for transgenic crops research. Currently this is achieved with protein reference standards which may take a significant time or efforts to obtain and there is a need for rapid protein detection without protein reference standards. RESULTS: A sensitive and specific method was developed to detect target proteins in transgenic maize leaf crude extract at concentrations as low as ∼30 ng mg(-1) dry leaf without the need of reference standards or any sample enrichment. A hybrid Q-TRAP mass spectrometer was used to monitor all potential tryptic peptides of the target proteins in both transgenic and non-transgenic samples. The multiple reaction monitoring-initiated detection and sequencing (MIDAS) approach was used for initial peptide/protein identification via Mascot database search. Further confirmation was achieved by direct comparison between transgenic and non-transgenic samples. Definitive confirmation was provided by running the same experiments of synthetic peptides or protein standards, if available. CONCLUSION: A targeted proteomic mass spectrometry method using MIDAS approach is an ideal methodology for detection of new proteins in early stages of transgenic crop research and development when neither protein reference standards nor antibodies are available. © 2016 Society of Chemical Industry.

High HIV Burden in Men Who Have Sex with Men across Colombia's Largest Cities: Findings from an Integrated Biological and Behavioral Surveillance Study.

BACKGROUND: Among Latin America's concentrated HIV epidemics, little is known about men who have sex with men (MSM) in Colombia, the region's third largest country. To date, surveillance studies have been limited to Bogota, while 80% of HIV cases and deaths originate from Colombia's other cities and departments. The extent to which interventions should prioritize MSM outside of Bogota is unknown. METHODS: We recruited 2603 MSM using respondent-driven sampling from seven of Colombia's largest cities. HIV prevalence was estimated by site from dried blood spot samples. Behavioral data were collected through face-to-face interviews and risk factors for HIV infection analyzed using weighted, multi-level logistical regression models accounting for recruitment patterns. RESULTS: Across cities, HIV prevalence averaged 15%, varied from 6% to 24% and was highest in Cali, Bogota, and Barranquilla. In the past 12 months, 65% of MSM had ≥ 5 casual male partners and 23% had a female partner. Across partnerships (i.e., casual, stable, and commercial), the proportion of MSM engaging in unprotected sex was ≥ 52% with male partners and ≥ 66% with female partners. Self-reported history of STI (24%) and past-year illicit drug use (38%) were also common. In multivariate analysis, age ≥ 35 (adjusted odds ratio [AOR], 19.2) and 25-39 (AOR, 5.6) relative to ≤ 18-24 years, identifying as homosexual relative to heterosexual (AOR 0.1), meeting casual partners on the Internet (adjusted odds ratio [AOR], 3.1) and age of sexual debut of ≤ 13 years (AOR, 3.1) predicted HIV infection. HIV testing and prevention messaging reached just 24% of MSM in the past year. CONCLUSIONS: Findings support consistently elevated HIV burden among MSM throughout Colombia's largest cities and a need for enhanced behavioral prevention and HIV testing, emphasizing men who use the Internet as well as physical venues to meet sex partners.

Southern-by-Sequencing: A Robust Screening Approach for Molecular Characterization of Genetically Modified Crops.

Molecular characterization of events is an integral part of the advancement process during genetically modified (GM) crop product development. Assessment of these events is traditionally accomplished by polymerase chain reaction (PCR) and Southern blot analyses. Southern blot analysis can be time-consuming and comparatively expensive and does not provide sequence-level detail. We have developed a sequence-based application, Southern-by-Sequencing (SbS), utilizing sequence capture coupled with next-generation sequencing (NGS) technology to replace Southern blot analysis for event selection in a high-throughput molecular characterization environment. SbS is accomplished by hybridizing indexed and pooled whole-genome DNA libraries from GM plants to biotinylated probes designed to target the sequence of transformation plasmids used to generate events within the pool. This sequence capture process enriches the sequence data obtained for targeted regions of interest (transformation plasmid DNA). Taking advantage of the DNA adjacent to the targeted bases (referred to as next-to-target sequence) that accompanies the targeted transformation plasmid sequence, the data analysis detects plasmid-to-genome and plasmid-to-plasmid junctions introduced during insertion into the plant genome. Analysis of these junction sequences provides sequence-level information as to the following: the number of insertion loci including detection of unlinked, independently segregating, small DNA fragments; copy number; rearrangements, truncations, or deletions of the intended insertion DNA; and the presence of transformation plasmid backbone sequences. This molecular evidence from SbS analysis is used to characterize and select GM plants meeting optimal molecular characterization criteria. SbS technology has proven to be a robust event screening tool for use in a high-throughput molecular characterization environment.

Effects of earthworm (Eisenia fetida) and wheat (Triticum aestivum) straw additions on selected properties of petroleum-contaminated soils.

Current bioremediation techniques for petroleum-contaminated soils are designed to remove contaminants as quickly and efficiently as possible, but not necessarily with postremediation soil biological quality as a primary objective. To test a simple postbioremediation technique, we added earthworms (Eisenia fetida) or wheat (Triticum aestivum) straw to petroleum land-farm soil and measured biological quality of the soil as responses in plant growth, soil respiration, and oil and grease (O&G) and total petroleum hydrocarbon (TPH) concentrations. Results indicated that plant growth was greater in earthworm-treated land-farm soil. Furthermore, addition of wheat straw resulted in greater total respiration in all soils tested (land-farm soil, noncontaminated reference soil, and a 1:1 mixture of land-farm and reference soils). We observed a 30% increase in soil respiration in straw-amended oily soil, whereas respiration increased by 246% in straw-amended reference soil. Much of the difference between oily and reference soils was attributable to higher basal respiration rates of nonamended oily soil compared to nonamended reference soil. Addition of earthworms resulted in greater total respiration of all soil and straw treatments except two (the land-farm and the 1:1 mixture soil treatments without straw). Straw and earthworm treatments did not affect O&G or TPH concentrations. Nevertheless, our findings that earthworm additions improved plant growth and that straw additions enhanced microbial activity in land-farm soil suggest that these treatments may be compatible with plant-based remediation techniques currently under evaluation in field trials, and could reduce the time required to restore soil ecosystem function.

El acompañante masculino en la Unidad de Cuidades Intensivos / The male companion in the Intensive Care Unit

Se realiza un estudio en la Unidad de Cuidados Intensivos del Hospital Pediátrico "José L. Miranda" de Santa Clara, para conocer la frecuencia con que el padre ocupa el lugar de la madre en la atención del niño hospitalizado. Con este objetivo se encuestaron 54 acompañantes masculinos en el primer trimestre de 1987. El perfil ocupacional que predominó fue el de obrero. La mayor cifra de acompañantes encuestados tenían edades comprendidas entre los 17 y 25 años. Predominó el nivel escolar de secundaria básica entre los acompañantes. El mayor número de ellos no refirió afectación económica durante la enfermedad del niño. El deseo de permanecer junto al paciente y la imposibilidad de la madre para ello, fueron los motivos fundamentales de permanencia. Se dan a conocer las ventajas que el personal de enfermería reconoce en el acompañante masculino

Ventilación mecánica en el recién nacido: experiencia de 2 años de trabajo / Mechanical ventilation in the newborn: a two year experince

Se estudiaron 100 recién nacidos sometidos a tratamiento con ventilación mecánica durante los años 1986 y 1987, en la Unidad de Cuidados Intensivos del Hospital Pediátrico Provincial de Villa Clara. El 57 % del total estuvo comprendido en el grupo de más de 2 500 g de peso al nacimiento y el 41 % de ellos tuvo un Aggar menor de 7. De los recién nacidos con edad entre 0 a 6 días al inicio de la ventilación fallecieron 17, los que representaron el 65,4 % de este grupo. Se pudo demostrar que en el 36 y el 17 %, respectivamente, del total de pacientes, la hipoxia perinatal y la enfermedad de la membrana hialina fueron las entidades que más motivaron la ventilación. Se comprobó la sobrevida en el 36 % del total de niños ventilados. Las complicaciones más comúnmente halladas fueron la sepsis y el borotrauma

Ventilación mecánica en el recién nacido: experiencia de 2 años de trabajo / Mechanical ventilation in the newborn: a two year experince

Se estudiaron 100 recién nacidos sometidos a tratamiento con ventilación mecánica durante los años 1986 y 1987, en la Unidad de Cuidados Intensivos del Hospital Pediátrico Provincial de Villa Clara. El 57 % del total estuvo comprendido en el grupo de más de 2 500 g de peso al nacimiento y el 41 % de ellos tuvo un Aggar menor de 7. De los recién nacidos con edad entre 0 a 6 días al inicio de la ventilación fallecieron 17, los que representaron el 65,4 % de este grupo. Se pudo demostrar que en el 36 y el 17 %, respectivamente, del total de pacientes, la hipoxia perinatal y la enfermedad de la membrana hialina fueron las entidades que más motivaron la ventilación. Se comprobó la sobrevida en el 36 % del total de niños ventilados. Las complicaciones más comúnmente halladas fueron la sepsis y el borotrauma (AU)

El acompañante masculino en la Unidad de Cuidades Intensivos / The ale companion in the Intensive Care Unit

Se realiza un estudio en la Unidad de Cuidados Intensivos del Hospital Pediátrico "José L. Miranda" de Santa Clara, para conocer la frecuencia con que el padre ocupa el lugar de la madre en la atención del niño hospitalizado. Con este objetivo se encuestaron 54 acompañantes masculinos en el primer trimestre de 1987. El perfil ocupacional que predominó fue el de obrero. La mayor cifra de acompañantes encuestados tenían edades comprendidas entre los 17 y 25 años. Predominó el nivel escolar de secundaria básica entre los acompañantes. El mayor número de ellos no refirió afectación económica durante la enfermedad del niño. El deseo de permanecer junto al paciente y la imposibilidad de la madre para ello, fueron los motivos fundamentales de permanencia. Se dan a conocer las ventajas que el personal de enfermería reconoce en el acompañante masculino

Fracaso multiorgánico en la unidad de cuidados intensivos

Se estudiaron 104 pacientes que presentaron manifestaciones de fracaso multiorgánico (FMO) a su ingreso o en algún momento de su evolución en la unidad de cuidados intensivos (UCI) del Hospital Pediátrico de Santa Clara durante 1988. De ellos egresaron vivos 60 y fallecieron 44, con predominio de los menores de un año. La malnutrición por defecto fue un índice de mal pronóstico. El fracaso monofásico fue el de diagnóstico más frecuente. Las lesiones respiratorias y cardiovasculares constituyeron las causas iniciales de fracaso en un alto porcentaje de pacientes. Se observó una relación directa entre el número de sistemas en fallo y la mortalidad (AU)

Ventilación mecánica en el recién nacido: experiencia de tres años de trabajo / Mechanical ventilation in the newborn: A three year work experience

Se estudiaron 148 recién nacidos sometidos a tratamiento con ventilación mecánica durante los años 1986, 1987 y 1988 en la Unidad de Cuidados Intensivos del Hospital Pediátrico Docente "José L. Miranda" de Villa Clara. El 52%del total estuvo comprendido en el grupo de más de 2500 g de peso al nacer y el 56%de ellos tuvo un Apgar entre 7 y 10. De los recién nacidos con edad entre 0 y 1 día al inicio de la ventilación fallecieron 66, lo que representó el 65%de este grupo. Se pudo demostrar que la hipoxia, con el 51%del total de pacientes y la enfermedad de la membrana hialina, con el 26%, fueron las entidades que más necesitaron. Las complicaciones más frecuentes fueron: la sepsis y el barotrauma

Ventilación mecánica en el recién nacido: experiencia de tres años de trabajo / Mechanical ventilation in the newborn: A three year work experience

Se estudiaron 148 recién nacidos sometidos a tratamiento con ventilación mecánica durante los años 1986, 1987 y 1988 en la Unidad de Cuidados Intensivos del Hospital Pediátrico Docente "José L. Miranda" de Villa Clara. El 52%del total estuvo comprendido en el grupo de más de 2500 g de peso al nacer y el 56%de ellos tuvo un Apgar entre 7 y 10. De los recién nacidos con edad entre 0 y 1 día al inicio de la ventilación fallecieron 66, lo que representó el 65%de este grupo. Se pudo demostrar que la hipoxia, con el 51%del total de pacientes y la enfermedad de la membrana hialina, con el 26%, fueron las entidades que más necesitaron. Las complicaciones más frecuentes fueron: la sepsis y el barotrauma

Morbimortalidad en cuidados intensivos. Año 1985 / Morbimortality in intensive care. 1985

Se hizo un estudio de morbimortalidad en la UCI del Hospital Pediátrico Docente "José L Miranda" Santa Clara, Villa Clara, durante el año 1985. Se utilizaron todas las historias clínicas de los pacientes ingresados en ella agrupándose por edades, sexo, provincia de origen, tipo de ingreso, servicio de procedencia en caso de traslado, estadía, diagnóstico al egreso y causa de fallecimiento después de haber sido discutido en el Comité de Análisis de la Mortalidad. Se encontró un notable incremento en el número de ingresos con relación a 1984. Hubo aumento en la atención a pacientes menores de 1 año. En su mayoría los enfermos procedían de la provincia de Villa Clara. La sala de terapia intermedia aportó el mayor número de traslados. La enfermedad meningococica continuó siendo la causa más frecuente de ingreso en la Unidad aunque disminuye porcentualmente en comparación a 1984, disminuyendo también el número de fallecidos por esta causa

Morbimortalidad en cuidados intensivos. Año 1985 / Morbimortality in intensive care. 1985

Se hizo un estudio de morbimortalidad en la UCI del Hospital Pediátrico Docente "José L Miranda" Santa Clara, Villa Clara, durante el año 1985. Se utilizaron todas las historias clínicas de los pacientes ingresados en ella agrupándose por edades, sexo, provincia de origen, tipo de ingreso, servicio de procedencia en caso de traslado, estadía, diagnóstico al egreso y causa de fallecimiento después de haber sido discutido en el Comité de Análisis de la Mortalidad. Se encontró un notable incremento en el número de ingresos con relación a 1984. Hubo aumento en la atención a pacientes menores de 1 año. En su mayoría los enfermos procedían de la provincia de Villa Clara. La sala de terapia intermedia aportó el mayor número de traslados. La enfermedad meningococica continuó siendo la causa más frecuente de ingreso en la Unidad aunque disminuye porcentualmente en comparación a 1984, disminuyendo también el número de fallecidos por esta causa(AU)